Рестриктази - це що? Визначення та класифікація рестриктаз
Опубликованно 08.07.2018 00:10
Рестриктази — це особливі ферменти, здатні розрізати ланцюжка ДНК у певних місцях. Саме в специфічності дії полягає головна відмінність даної групи білків від інших видів эндонуклеаз. Завдяки цьому унікальному властивості ферменти рестрикції знайшли широке застосування в генній інженерії.
Рестриктази — це унікальні ферменти бактерій. Вперше ці білки були виділені в 1968 році з штамів Esherihia colli. Подальші дослідження виявили присутність эндонуклеаз рестрикції в одноклеточной водорості Chlorella, а також в декількох культурах дріжджів Sachoromyces і Pichia. В клітинах інших еукаріотів рестриктази поки не виявлені. Загальна характеристика
Рестриктази — ферменти, які відносяться до групи гідролаз, оскільки каталізують гідроліз фосфодиэфирной зв'язки між нуклеотидами в ланцюжку ДНК. Місце, в якому відбувається розрізання, називається сайтом рестрикції. Останній може знаходитися як всередині знаної послідовності, так і на відстані від неї.
Специфічний для рестриктази ділянку розпізнавання зазвичай складається з 4-8 нуклеотидів. Так як азотисті основи звернені всередину подвійної спіралі, фермент знаходить потрібну послідовність за рахунок взаємодії з великою борозенкою ДНК.
Кожна рестриктаза має свій сайт розпізнавання і може функціонувати тільки після зв'язування з ним. Біологічна роль
Бактерії рестриктази — це найважливіший інструмент захисту клітини від бактеріофагів. Основне завдання ферментів даної групи полягає в розрізанні проник у клітину чужорідного генетичного матеріалу. Фрагментованість нуклеїнової кислоти перешкоджає її реплікації, а отже, і розмноження вірусу.
Послідовності, до яких специфічні рестриктази, з певною періодичністю зустрічаються в геномі самої бактерії і тому піддаються метилированию, яке не дозволяє рестриктазам розпізнати свої мішені. Цей процес здійснюється ферментами метилазами.
Механізм, спрямований на розрізання чужорідної ДНК і захищає від нуклеазной активності власну, називається системою рестрикції-модифікації. Деякі типи рестриктаз здатні проявляти як эндонуклеазную, так і метилазную активність.
На даний момент відомо більше 1000 бактеріальних рестриктаз. Дуже часто вони розглядаються не як окремі ферменти, а в комплексі систем рестрикції-модифікації. Особливості дії рестриктаз
Після зв'язування з послідовністю розпізнавання ендонуклеази рестрикції по черзі розщеплюються ланцюга ДНК. При цьому можуть утворюватися два варіанти решт: Липкі — одноцепочечные комплементарні один одному послідовності, які легко можуть "сшиться" назад. Формуються при ступінчастою траєкторії розрізання, коли точки розщеплення двох кіл не збігаються; Тупі — одноцепочечные ділянки в місці розриву ДНК не утворюються, точки розрізання ланцюгів знаходяться навпроти один одного.
Для здійснення эндонуклеазной активності рестриктазам потрібно кофактор у вигляді Mg2+. Розташувавшись на місці розриву цей іон втручається в конфігурацію ДНК, що сприяє подальшому розщепленню.
Класифікація рестриктаз
За будовою та механізмом дії всі рестриктази поділяють на 2 класи. До першого відносяться ферменти, що володіють виключно рестрикційної активністю, а метилювання здійснюється іншим білком з аналогічною субстратної специфічністю.
Рестриктази класу II являють собою мультиферментні комплекси, здатні як розрізати, так і модифікувати ДНК. Ці білки складаються з 3 функціональних субодиниць: сайт-узнающей; метилирующей; рестриктирующей.
Є й інший різновид рестриктаз того ж класу, для якої характерна структура з двох субодиниць. Такі ферменти називають бифункциональными.
Метилазная і эндонуклеазная активності у різних рестриктаз можуть здійснюватися одночасно або виключати один одного. Ефект дії таких ферментів залежить від умов реакції.
В межах двох класів виділять три типи рестиктаз (I, II і III), які розрізняються за такими характеристиками: структурна організація; виконувані функції; особливості субстратної специфічності; потреба в кофакторах; розташування сайту рестрикції щодо ділянки розпізнавання; оборотність реакції рестрикційного гідролізу; потреба в енергії АТФ; механізм дії.
Тип II відповідає першому класу эндонуклеаз рестрикції, а перший і третій типи є різновидами класу II. Характеристика эндонуклеаз рестрикції Тип I II III Структура 3 різні субодиниці Одна або кілька ідентичних субодиниць 2 різні субодиниці Функції Рестрикція та метилювання Рестрикція Рестрикція та метилювання Реакції гідролізу і метилювання Взаємовиключні Окремі реакції (для кожної свій фермент) Можливо одночасне прояв Розташування сайту розрізання Випадкове, не менш 1000 пар нуклеотидів від розпізнаваної послідовності Всередині розпізнаваної послідовності На відстані 24-26 нуклеотидних пар від послідовності розпізнавання Кофакторы рестрикції S-анедозил-L-метіонін (Адо-мет), Mg2+, АТФ Mg2+
Mg2+, АТФ (необхідні);
Адо-мет (необов'язковий, стимулює реакцію) Кофакторы метилювання
Адо-мет (необхідний);
Mg2+ і АТФ (стимулюють реакцію) немає метилювання
Адо-мет (необхідний);
Mg2+ і АТФ (стимулюють реакцію) Энзиматическая оборотність реакції рестриктазной Є Немає Немає Послідовність розпізнавання Переривчаста, обертальна симетрія відсутній Короткі послідовності, які мають обертальної симетрії другого порядку Послідовність має деякі елементи симетрії або повністю позбавлена останньої Транслокація ДНК перед розрізанням Є Немає Немає
Крім трьох основних різновидів рестриктаз виділяють ще два типу: IIS — відрізняється від типу II тим, що система рестрикції-модифікації кодується не двома, а трьома генами, а сайт розрізання знаходиться поза послідовності розпізнавання (на фіксованій відстані); Mcr/Mrr — містить кілька різних субодиниць при відсутності модифікаційний активності, для роботи потрібно ГТФ, розщеплює ДНК з метилированными аденином і цитозином.
Рестриктази першого і третього типів характеризуються неповним гідролізом ланцюгів ДНК і тому практично не використовуються в технології генної інженерії. Номенклатура
Зазвичай у назві рестриктази міститься інформація про те, з якого мікроорганізму вона була виділена. При цьому, інформація вказується в такому порядку: род і вид; штам; номер ферменту (якщо даний мікроорганізм містить кілька систем рестрикції-модифікації).
Іноді назва включають інформацію про локалізацію генів, що кодують рестриктазу.
Номенклатура для рестрикційних ферментів була розроблена Сміттом і Натансом. Вона базується на наступних принципах: Перша латинська літера позначає рід, а дві наступні - вид мікроорганізму. Далі латинської букової вказується штам або внехромосомный елемент, що кодує рестриктазу. У кінці римської цифрою позначається номер ферменту.
Таким чином, друга за рахунком рестриктаза, виділена із штаму d бактерії Haemophilus influenzae буде позначатися HindII. Изошизомеры
Існує ще одна класифікація ферментів рестрикції, що базується на їх специфічності до субстрату.
Изошизомеры — це рестриктази з різним походженням, але однаковою субстратної специфічністю. Такі рестриктази можуть бути виділені навіть з віддалених таксонів бактерій. Відкриття изошизомеров спростувало припущення про суворої таксоноспецифичности рестриктаз, утверждавшее, що ділянки розпізнавання для цих ферментів у різних видів мікроорганізмів унікальні. Неошизомеры
Неошизомерами називаються рестриктази, що мають загальний ділянка розпізнавання, але різні сайти рестрикції. Наприклад, для ферментів SmaI і XmaI специфічна послідовність CCCGGG, але в одному випадку розрізання проходить посередині (CCC/GGG), а в іншому розщеплюється зв'язок між першим і другим нуклеотидами (C/CCGGG). Изокаудомеры
До изокаудомерам відносять ферменти рестрикції з різною субстратної специфічністю, які формують однакові кінці. Передбачається, що білки даної групи не є спорідненими. Застосування рестриктаз
Рестриктази є одним з головних молекулярних інструментів, що використовуються в технології рекомбінантних ДНК. Завдяки цим ферментам стало можливим вирізати з геномів різних організмів певні фрагменти або гени, а потім зшивати їх за допомогою лигаз.
Особливо зручно використання в генній інженерії рестриктаз, утворюють однакові липкі кінці. Такі фрагменти ДНК легко з'єднуються за принципом комплементарності Автор: Лідія Шерстова 6 Липня, 2018
Категория: Студентам